Pusa Mutagenesis Faʻatonutonuina o le Nofoaga vave

A-1 Faʻataʻitaʻiga

■ O le faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai ni polotini polotito poʻo Taq inhibitors, ma isi.

■ E le o maeʻa le faʻavaeina o faʻataʻitaʻiga - - Faʻalelei talafeagai le vevela o le sauniga ma faʻafualoa le taimi o le faʻasologa.

■ Faʻalumaina o le faʻataʻitaʻiga —— Toe sauni le faʻataʻitaʻiga.

A-2 Faʻatomuaga

■ Le lelei le lelei o faʻamuamua ——Re toe faʻafouina le amataga.

■ Faʻaleagaina muamua --— Faʻavae muamua le maualuga o le faʻasusu i tamaʻi tusi mo le faʻasaoina. Aloese mai le tele o le malulu ma le liusuavai poʻo le umi taimi 4 ° C cryopreserve.

■ Le fetaui lelei le faʻavaeina o primers (eg primer length e le lava, dimer fausia i le va o primers, ma isi) -Redesign primers (aloese mai le fausiaina o primer dimer ma tulaga lua fausaga)

A-3 Mg²⁺taulaʻi

■ Mg²⁺ ua maualalo tele le faʻatatau --— Faʻalelei lelei Mg²⁺ faʻamalosia: Faʻalelei le Mg²⁺ faʻamalosia e se faʻasologa o tali mai 1 mM i le 3 mM ma le va o le 0.5 mM e fuafua ai le sili lelei Mg²⁺ faʻasologa mo taʻitasi template ma primer.

A-4 Annealing vevela

■ O le maualuga annealing vevela aafia ai le fusia o primer ma template. —— Faʻaitiitia le vevela faʻapipiʻi ma faʻalelei le tulaga i le gradient o le 2 ° C.

A-5 Faʻasologa o taimi

■ Taimi faʻaopoopo puupuu —— Faʻateleina taimi faʻaopopo.

Phenomena: O faʻataʻitaʻiga le lelei e faʻaalia ai foʻi faʻasologa o faʻasologa.

A-1 Faʻaleagaina o PCR

■ Faʻalavaveina faʻaleagaina o faʻasologa faʻasologa poʻo le faʻateleina o oloa --— Faʻaeteete aua neʻi pipuina le faʻataʻitaʻiga o loʻo i ai le faʻasologa faʻatulagaina i le le lelei faʻataʻitaʻiga pe faʻamaligiina i fafo mai le centrifuge tube. O reagents poʻo mea faigaluega e tatau ona autoclaved e aveʻese ai nei nucleic acid, ma le i ai o faʻaleagaina tatau ona fuafuaina e ala i le le lelei faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga.

■ Faʻaleagaina faʻaleagaina ——Faʻamaʻaina meaʻai ma faleoloa i le maualalo o le vevela.

A-2 Palemiar

■ Mg²⁺ ua maualalo tele le faʻatatau --— Faʻalelei lelei Mg²⁺ faʻamalosia: Faʻalelei le Mg²⁺ faʻamalosia e se faʻasologa o tali mai 1 mM i le 3 mM ma le va o le 0.5 mM e fuafua ai le sili lelei Mg²⁺ faʻasologa mo taʻitasi template ma primer.

■ Le fetaui lelei le ata muamua, ma le faʻasologa faʻatulagaina ei ai homology ma le lē faʻatulagaina faʻasologa. ——Re-design primers.

Phenomena: O faʻamau faʻalauteleina PCR e le ogatusa ma le tele fuafuaina, a le o le tele poʻo le laʻititi, poʻo nisi taimi uma faʻapitoa faʻalauteleina fusi ma le faʻapitoa faʻalauteleina fusi tupu.

A-1 Faʻatomuaga

■ Lelei faʻatulagaina primer

——Re-design primer.

■ O le faʻamuamua primer e maualuga tele —— Faʻalelei lelei le denaturation vevela ma faʻafualoa taimi denaturation.

A-2 Mg²⁺ taulaʻi

■ O le Mg²⁺ ua maualuga tele le faʻatonuina - - Faʻaitiitia lelei le faʻateteleina o le Mg2 +: Faʻaaoga lelei le Mg²⁺ faʻamalosia e se faʻasologa o tali mai 1 mM i le 3 mM ma le va o le 0.5 mM e fuafua ai le sili lelei Mg²⁺ faʻasologa mo taʻitasi template ma primer.

A-3 Thermalable polymerase

■ Ova aofaʻi o le enzyme —— Faʻaitiitia talafeagai le aofaʻi o le enzyme i vaitaimi o le 0.5 U

A-4 Annealing vevela

■ O le vevela faʻapipiʻi e maualalo tele —— Faʻalelei talafeagai le faʻapipiʻiina o le vevela pe faʻaogaina le lua-tulaga faʻamamaina auala

A-5 PCR taʻamilosaga

■ Ova tele taʻamilosaga PCR —— Faʻaitiitia le aofaʻi o taʻavale PCR.

A-1 Faʻatomuaga——E le lelei le faʻamatalaina --- Le toe mamanuina o le tusi muamua, suia le tulaga ma le umi o le tusi muamua e faʻaleleia atili ai lona faʻapitoa; pe faʻataʻitaʻi PCR faʻamoe.

A-2 Faʻataʻitaʻiga DNA

——E le mamā le faʻataʻitaʻiga --— Faʻamama le ata pe aveese DNA ma ato faʻamama.

A-3 Mg²⁺ taulaʻi

——Mai²⁺ ua maualuga tele le faʻatonuina - - Faʻaitiitia tatau le Mg²⁺ faʻamalosia: Faʻalelei le Mg²⁺ faʻamalosia e se faʻasologa o tali mai 1 mM i le 3 mM ma le va o le 0.5 mM e fuafua ai le sili lelei Mg²⁺ faʻasologa mo taʻitasi template ma primer.

A-4 dNTP

—— O le faʻatulagaina o dNTPs e maualuga tele —— Faʻaitiitia talafeagai o le dNTP

A-5 Annealing vevela

——Talu maualalo tele le vevela faʻapipiʻi —— Faʻatuputeleina le vevela faʻapipiʻi

A-6 Taamilosaga

—— Matua tele taʻamilosaga —— Faʻamamafa le numera ole taʻamilosaga

O le laʻasaga muamua o le filifili lea o le polymerase talafeagai. Ole Taq polymerase masani e le mafai ona faʻamaonia ona o le le lava o le 3'-5 'exonuclease gaoioiga, ma le le fetaui lelei o le a matua faʻaititia ai le faʻalauteleina o le aoga o vaega. O le mea lea, o le Taq polymerase masani e le mafai ona faʻamalosia lelei vaega faʻatulagaina lapoʻa nai lo le 5 kb. Taq polymerase ma faʻapitoa suiga poʻo isi maualuga aiai ai polymerase tatau ona filifilia e faʻaleleia atili faʻalautelega lelei ma faʻamalieina ai manaʻoga o le umi fragment amplification. I se faʻaopopoga, o le faʻalauteleina o uumi vaega e manaʻomia foʻi fetuʻunaʻiga o uluaʻi mamanu, denaturation taimi, faʻaopoopoga taimi, buffer pH, ma isi masani, primers ma 18-24 bp mafai ona taʻitaʻia ai i sili lelei fua. Ina ia mafai ona puipuia le faʻaleagaina o le faʻavasega, o le taimi o le tino i le 94 ° C e tatau ona faʻaititia i le 30 sekone pe itiiti ifo i le taʻamilosaga, ma le taimi e faʻatupu ai le vevela i le 94 ° C ao le i faʻateleina le tatau ona laʻititi ifo i le 1 min. E le gata i lea, o le faʻatulagaina o le faʻalauteleina o le vevela pe a ma le 68 ° C ma le fuafuaina o le faʻaopoopoga taimi e tusa ai ma le fua faatatau o le 1 kb / min mafai ona mautinoa le faʻalauteleina aoga o umi fasi.

O le sese fua o le PCR faʻateleina mafai ona faʻaititia i le faʻaaogaina o DNA eseese polymerases ma maualuga faʻamaoni. Faʻatasi ai ma Taq DNA polymerases o loʻo maua i le taimi nei, o le Pfu enzyme o loʻo i ai le tau maualalo maualalo ma le maualuga o le faʻamaoni. I le faʻaopopoga i le filifiliga o le enzyme, e mafai e tagata suʻesuʻe ona faʻaititia le suiga o le PCR i le faʻamautinoaina o tulaga o tali atu, e aofia ai le faʻamautinoaina o le faʻapipiʻiina o le buffer, o le totoʻa o le polymerase ma le faʻamautinoaina o le numera o le taʻamilosaga a le PCR.