TIANSeq paulia RNA-Seq Pusa (illumina)

I le taimi nei, maualuga-throughput faʻasologa tekonolosi e tele lava ina faʻavae i luga o le isi augatupulaga faʻasologa tekonolosi. A o le faitauga umi o le isi augatupulaga faʻasologa tekonolosi e faʻatapulaʻaina, e tatau ona tatou gagau le atoa atoa faʻasologa i tamaʻi potu faletusi i le faʻasologa. E tusa ai ma manaʻoga o faʻasologa eseʻese faʻataʻitaʻiga, e masani ona tatou filifilia faʻasologa tasi poʻo faʻalua. I le taimi nei o DNA vaega o le isi augatupulaga faʻasologa faletusi e masani ona tufatufaina i le va o le 200-800 bp.

a) DNA e leaga i le tulaga lelei ma e iai mea e faʻalavelave ai. Faʻaaoga faʻataʻitaʻiga DNA sili ona lelei e aloese mai le taofiofia o le gaioiga o gaioiga.

b) Le aofaʻi o DNA faʻataʻitaʻiga e le lava pe a faʻaaogaina PCR-leai metotia e fausia DNA faletusi. Pe a oʻo i le 50 ng le sao o le DNA ninii, o le PCR-leai se galuega e mafai ona filifilia i le taimi o le fausiaina o le potu tusi. Afai o le kopi numera o le potutusi e maualalo tele e faʻasaʻo faʻasolo ai, o le DNA faletusi mafai ona faʻateleina e PCR i le maeʻa ai o le adapter ligation.

c) Faʻaleagaina RNA e mafua ai le le saʻo muamua DNA faʻavasegaina RNA faʻaleagaina ono i ai i le faʻamamaina o le genomic DNA, lea e ono taitai atu ai i le le saʻo DNA aofaʻiga ma le lava DNA utaina i le taimi o le fausiaina faletusi. RNA mafai ona aveʻese i le togafitia ma RNase.

A-1

a) Tamaʻi ninii (60 bp-120 bp) aliali O tamaʻi vaega e masani ona faʻapipiʻi vaega poʻo ni atisi na fausia e mea faʻapipiʻi. Faamamaina ma Agencourt AMPure XP manoa manoa mafai lelei aveʻesea nei adapter fasi ma mautinoa faʻasologa lelei.

b) Nisi lapisi foliga mai i le potu tusi pe a maeʻa PCR amplification O le tele o le faletusi DNA vaega o le a faʻateleina e 120 bp pe a maeʻa le adapter ua faʻapipiʻiina. Afai o le DNA fasi faʻateleina e sili atu nai lo 120 bp i le maeʻa ai o le adapter ligation, atonu e mafua mai i le le masani ai vaega faʻateleina o le tele PCR faʻateleina. Faʻaitiitia le numera o PCR taʻamilosaga mafai ona puipuia le tulaga.

i) Le tele masani o potutusi DNA fasi pepa pe a maeʻa adapter ligation O le umi o le adaptor i lenei pusa o le 60 bp. A faʻasoʻoina pito e lua o le fasi i mea faʻapipiʻi, o le umi e faʻateleina e le 120 bp. A faʻaaoga se mea e faʻaaoga e ese mai i le mea na saunia e lenei pusa, faʻamolemole faʻafesoʻotaʻi le tagata na te tuʻuina mai e tuʻuina mai faʻamatalaga talafeagai e pei o le umi o le adaptor. Faʻamolemole ia mautinoa o le suʻega workflow ma faʻagaioiga mulimuli i laʻasaga faʻamatalaina i le tusi lesona.

d) Le masani DNA fasi lapoʻa luma le adapter ligation O le mafuaʻaga mo lenei faʻafitauli e ono mafua mai i le sese tali atu tulaga i le taimi o DNA fragmentation. Eseesega taimi e tali atu ai e tatau ona faʻaaogaina mo eseesega o DNA. Afai o le DNA input e sili atu nai lo le 10 ng, matou te fautuaina ia filifili le tali atu i le taimi o le 12 min o le amataga o le taimi mo le faʻalelei, ma o le fasi vaega na gaosia i lenei taimi e tele lava i le tulaga o le 300-500 bp. E mafai e tagata faʻaaoga ona faʻateleina pe faʻaititia le umi o fasi DNA mo le 2-4 min e tusa ai ma a latou lava manaʻoga e faʻalelei ai vaega o le DNA ma le tele manaʻomia.

A-2

a) E le faʻamautuina le taimi faʻavasegaina Afai o le fragmented DNA e laʻititi pe tele tele, faʻamolemole vaʻai i le Faʻatonuga mo Fragmentation Taimi Filifiliga saunia i le faʻatonuga e iloa ai le tali atu taimi, ma faʻaaoga lenei taimi manatu o se faʻatonutonu, faʻaopoopo faʻatulagaina se tali atu i faʻafitauli e faʻaumiumi pe faʻapuʻupuʻu le 3 min ina ia faʻatonuina le fetuʻunaʻi o taimi malepelepe.

A-3

Le tele masani tufatufaina o DNA pe a uma vaevaega togafitiga

a) Sese metotia faʻalavaina o fragmentation reagent, pe o le reagent e le o maeʻa fefiloi pe a uma ona fofo. Faʻasusu i le aisa le 5 × Fragmentation Enzyme Mix. A uma loa ona liu suavai, palu faʻafefiloi le mea e ala i le mimigi lemu o le pito o le paipa. Aua le vortex le reagent!

b) O le faʻataʻitaʻiga o faʻatonuga ole DNA e iai le EDTA poʻo isi mea faʻaleagaina O le faʻaumatia o masima masima ma chelating agents i le faʻamamaina ole DNA laʻasaga e taua tele mo le manuia o le faʻataʻitaʻiga. Afai e faʻamaʻapeina le DNA i le 1 × TE, faʻaaoga le metotia o loʻo saunia i le faʻatonuga e faʻatino ai le vaevaeina. Afai o le EDTA faʻapitoa i le vaifofo e le o mautinoa, e fautuaina e faʻamama le DNA ma faʻamamaina i le vai deionized mo mulimuli ane tali.

i) Le saʻo faʻamatalaga muamua DNA, O le tele o DNA ua vaeluaina e fesoʻotaʻi vavalalata ma le aofaʻi o le faʻauluina o DNA. Ae le i vaeluaina togafitiga, sao le aofaʻiina o DNA faʻaaogaina Qubit, Picogreen ma isi metotia e taua e fuafua ai le aofaʻi tonu o DNA i le tali atu sisitema.

 d) O le sauniuniga o le tali atu o le tino e le mulimulitaʻi i le faʻatonuga O le sauniuniga o le vaeluaina o le tali atu o le tino e tatau ona faia i luga o le aisa e tusa ai ma faʻatonuga. Ina ia mautinoa le sili ona lelei aʻafiaga, tatau ona faʻapipiʻi uma vaega o le tali atu i luga o le aisa ma o le sauniuniga o le tali atu e tatau ona faʻataunuʻuina ina ua maeʻa maeʻa faʻamalulu. A maeʻa le sauniuniga, faʻamolemole palu pe faʻapipiʻi e palu faʻalelei. Aua le fai vortex!

1. Le fetaui lelei auala (paluga, oscillation vevesi, ma isi) o le a mafua ai le le tufatufaina o vaega o le potutusi (e pei ona faʻaalia i le ata lea), ma aʻafia ai le tulaga lelei o le faletusi. O le mea lea, pe a sauniuni le Fragmentation Mix tali tali, faʻamolemole malie pipette luga ma lalo e palu, pe faʻaaoga le tamatamai lima e mimigi ma palu faʻatasi. Faʻaeteete aua neʻi filogia ma le vortex.

2. Mau maualuga DNA e tatau ona faʻaaogaina mo le fausiaina o potutusi

■ Lelei DNA faʻamaoni: O le electrophoresis band e sili atu i le 30 kb, aunoa ma le faʻasologa

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. DNA sao aofaʻi e tatau ona saʻo E fautuaina e faʻaaoga Qubit ma PicoGreen metotia e faitaulia ai le DNA, ae le o Nanodrop.

4. O mea o loʻo i totonu ole EDTA ile DNA solution e tatau ona fuafuaina O le EDTA e iai sona aafiaga tele ile tali atu ole vaega na vaevaeina. Afai e maualuga le aano o le EDTA, e manaʻomia le faʻamamaina o le DNA ae le i faia le isi suʻega.

5. O le vaevaega tali tali e tatau ona saunia luga o le aisa. O le vaevaeina gaioiga e maaleale i le tali atu i le vevela ma le taimi (aemaise pe a maeʻa ona faʻaopopo le mea e faʻaleleia ai mea). Ina ia mautinoa le saʻo o taimi tali, faʻamolemole sauniuni tali i luga o le aisa.

6. E tatau ona saʻo le taimi e fai ai le vaevaega O le taimi e tali ai le vaevaega o le a aafia tonu ai le lapoʻa o oloa, ona afaina ai lea o le tufatufaina o vaega o DNA i le faletusi.

1. O le a le ituaiga o faʻataʻitaʻiga e talafeagai i lenei ato?

O le ituaiga talafeagai ituaiga o lenei pusa e mafai ona atoa RNA pe faʻamamaina mRNA ma lelei RNA faʻamaoni. A faʻaaogaina le RNA atoa e fausia ai le faletusi, e fautuaina e faʻaaoga le ato faʻaitiitia o le rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) e aveʻese muamua ai le rRNA.

2. Mafai e le FFPE faʻataʻitaʻiga mafai ona faʻaaogaina e fausia ai faletusi ma lenei pusa?

O le mRNA i FFPE faʻataʻitaʻiga o le a faʻaleagaina i se tasi tulaga, ma faʻatatau le lelei amio saʻo. A faʻaogaina le kit lea mo le fausiaina o le potutusi, e fautuaina e faʻalelei le taimi e vaevaeina ai (faʻapuʻupuʻu le taimi faʻavasegaga pe le faʻatinoina le vaevaega).

3. Faʻaaogaina o le laʻasaga filifilia laʻasaga saunia i le oloa tusi lesona, o le a le mea ono mafua ai le faʻaofiina vaega e foliga mai o se faʻaletonu?

O le tele o filifiliga e tatau ona faia i se tulaga saʻo e tusa ai ma le lapopoʻa o filifiliga i lenei tusi lesona. Afai e i ai le mimilo, o le mafuaʻaga atonu o le manoa lopa e le paleni i le potu vevela pe e le o maeʻa fefiloi, o le pipette e le saʻo pe o le vai i le pito. E fautuaina e faʻaaoga ia motugaafa ma maualalo adsorption mo le faʻataʻitaʻiga.

4. Filifiliga o mea e faʻaogaina mo le fausiaina o potutusi

O le faletusi fausia fale e leʻo iai le soʻotaga adapter, ma e fautuaina e faʻaaoga lenei ato faʻatasi ma le TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC o le faletusi

Faletusi aofaʻiga mauaina: Qubit ma qPCR e faʻaaogaina e fuafua ai le tele faʻaputuga faʻatosina ma molar faʻasologa faʻatulagaina i le faasologa. O le faʻagaioiga e matua ogatusa ma le tusi lesona a le oloa. O le faʻatulagaina o le potutusi o le a masani ona ausia manaʻoga o le NGS faʻasologa. Mauaina o le faletusi tufatufa laina: Faʻaaogaina Agilent 2100 Bioanalyzer e iloa ai le faletusi tufatufa laina.

6. Filifiliga o numera faʻateleina taʻamilosaga

E tusa ai ma faʻatonuga, o le numera o taʻamilosaga PCR o le 6-12, ma le numera o PCR taʻamilosaga manaʻomia e tatau ona filifilia e tusa ai ma le faʻaulufaleina o faʻatonuga. I faletusi maualuga-fua, o faʻateleina amplification masani ona tupu i eseesega tikeri, lea e faʻaalia e se laʻititi sili tumutumu ina ua maeʻa le tumutumu o le laina faʻatulagaina i le mauaina o Agilent 2100 Bioanalyzer, poʻo le maitauina faʻamaoniga o Qubit e maualalo nai lo le qPCR. O le agamalu nai lo le faʻateleina o se mea masani, lea e le aʻafia ai le faʻasologa o potu tusi ma faʻamaumauga mulimuli ane.

7. O tuʻuga o loʻo aliali mai ile faʻailoga o Agilent 2100 Bioanalyzer

O le aliali mai o fao i le Agilent 2100 Bioanalyzer mauaina ona o le le laugatasia o vaevaega o faʻataʻitaʻiga, lea o le a tele ai fasi i nisi ituaiga, ma o lenei o le a sili atu ona manino ina ua maeʻa le PCR tamaoaiga. I lenei tulaga, ua fautuaina e aua le faia le tele filifiliga, ie faʻatulagaina le vaevaega tulaga i le 94 ° C mo le 15 min incubated, lea o le fasi tufatufaina e laʻititi ma faʻalauteleina, ma le homogeneity mafai ona faʻaleleia.