FastKing RT Pusa (Faatasi ai ma gDNase)

A-1 RNA ua faʻaleagaina

——Faʻamama le RNA sili ona lelei e aunoa ma se faʻaleagaina. O mea na aumai mai le RNA e tatau ona matua fou peʻa mafai e puipuia ai le faʻaleagaina ole RNA. Suʻesuʻe le faʻamaoni RNA ile gel faʻaali ae leʻi tali mai le RT. A maeʻa ona toʻesea le RNA, e tatau ona teuina ile 100% formamide. Afai e faʻaaogaina le RNase inhibitor, o le vevela o le vevela e tatau ona <45 ° C, ma o le pH e tatau ona itiiti ifo i le 8.0, a leai o le mea e faʻatamaia e faʻasaʻoloto uma le RNase. E le gata i lea, o le RNase taofi e tatau ona faʻaopopo i fofo o loʻo aofia ai le 8 0.8 mM DTT.

A-2 RNA e iai ni mea e taofia ai le toe suia o uiga o faʻamatalaga

—— Faʻamalosi transcript faʻatamaina aofia SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, guanidine masima, ma isi. Faʻafefiloi le RNA faʻatonutonu ma le faʻataʻitaʻiga, ma faʻatusatusa le faʻatagaina ma le taofiofi RNA tali e siaki pe o iai se mea e taofia. Fufulu le RNA faʻasusu ma le 70% (v / v) ethanol e aveʻese ai mea faʻalavelave.

A-3 Le lava faʻapipiʻiina o primers faʻaaoga mo le tuʻufaʻatasia o le muamua fua o le cDNA

——Faamaonia o le faʻamamaluina o le vevela e talafeagai mo primers faʻaaogaina i le faʻataʻitaʻiga. Mo soxamers soʻo, e fautuaina e faʻatumau le vevela ile 25 ° C mo le 10 minu ae e leʻi oʻo ile vevela o tali. Mo kenera-faʻapitoa primers (GSP), faʻataʻitaʻi isi GSP, pe fesuiaʻi i le oligo (dT) poʻo seva hexamer.

A-4 Laʻititi aofaʻi o amata RNA

—— Faʻateleina le aofaʻi o RNA. Mo RNA faʻataʻitaʻiga laititi ifo i le 50 ng, 0.1 μg i le 0.5 μg acetyl BSA mafai ona faʻaaogaina i le muamua strand cDNA synthesis

A-5 O le faʻatulagaina o faʻasologa e leʻo faʻaalia i vaega ua suʻesuʻeina.

—— Faʻataʻitaʻi isi sela.

A-6 PCR tali le manuia

——Mo le lua-sitepu RT-PCR, ole cDNA template ile laʻasaga PCR e le mafai ona sili atu i le 1/5 o le aofaʻi o tali.

A-1 Le faʻapitoa faʻapipiʻiina o primers ma faʻataʻitaʻiga

——O le 3'-iʻuga o primers le tatau ona aofia ai le 2-3 dG poʻo le DC. Faʻaaoga prim-faʻapitoa primers i le muamua strand synthesis ae le o soo se mea muamua poʻo le oligo (dT). Faʻaaoga se vevela pupuni maualuga i nai muamua taʻamilosaga, ona faʻamamaina ai lea o le vevela. Faʻaaoga le vevela-amata Taq DNA polymerase mo PCR e faʻaleleia atili ai le faʻapitoa o le tali atu.

A-2 Le lelei le fuafuaina o gafa-faʻapitoa primers

—Faia ia lava mataupu faʻavae mo le faʻateleina o le tusi muamua.

A-3 RNA faʻaleagaina i genomic DNA

——Treat RNA ma le PCR-grade DNase I. Faʻatulaga se tali faʻatonutonu e aunoa ma le toe faʻaliliuina e iloa ai le faʻaleagaina o DNA.

A-4 Fausiaina o le primer dimer

—— Tusi ni tusi muamua e aunoa ma ni faʻasologa lelei i le 3 'faaiuga.

A-5 Maualuga Mg²⁺ taulaʻi

——Faʻaaoga le Mg²⁺ faʻamalosia mo taʻitasi template ma primer tuʻufaʻatasiga

A-6 Faʻaleagaina ma fafo DNA

—— Faʻaoga motugaafa e le mafai ona tali atu i le aerosol ma UDG enzymes.

A-1 O mea o loʻo muamua i le fuafuati oloa e maualuga tele

——Faʻitiitia le aofaʻi o le fuafuati muamua i le laʻasaga masani a le PCR.

A-2 Maualuga maualuga primer aofaʻi i le PCR tali atu

—— Faʻaitiitia le faʻaulufale muamua.

A-3 Ua tele naua taʻamilosaga

——Faʻamaonia tulaga o tali atu a le PCR ma faʻaititia le numera o le taʻamilosaga a le PCR.

A-4 laʻititi maualalo vevela faʻapipiʻiina

—— Faʻateleina le faʻamamaluina o le vevela e puipuia ai le amataina ma le faʻaopopoga.

A-5 Le faʻapitoa le faʻateleina o vaega o le oligonucleotide na fausia e le DNase faʻaleagaina o DNA - Faʻaaoga le maualuga o le RNA e puipuia ai le faʻaleagaina o DNA.

RT-PCR o le toe fesuiaʻi tusia le RNA i le cDNA, ona faʻaaoga ai lea o le toe sui tusia cDNA o se faʻataʻitaʻiga mo PCR tali atu e faʻalauteleina ai le vaega faʻatulagaina. Filifili se mea muamua, Oligo dT ma le kenera faʻapitoa primers e tusa ai ma tuʻutuʻuga tulaga o le faʻataʻitaʻiga. O mea uma na taʻua i luga e mafai ona faʻaaogaina mo mRNA pupuu eukaryotic cell e aunoa ma le fausaga o lauulu.

Random primer: Fetaui mo le umi RNA ma hairpin fausaga, faʻapea foi ma ituaiga uma o RNA pei o rRNA, mRNA, tRNA, ma isi Latou masani ona faʻaaogaina mo RT-PCR tali atu o le tasi faʻataʻitaʻiga.

Oligo dT: E talafeagai mo le RNA ma le PolyA tailing (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo dT rRNA ma le tRNA e leai ni iʻu PolyA). Talu ai o Oligo dT e fusifusia i le PolyA tail, o le lelei o RNA faʻataʻitaʻiga e manaʻomia e maualuga, ma e oʻo lava i sina laʻititi o le faʻaleagaina o le a matua faʻaititia ai le aofaʻi o le atoa-umi cDNA faʻasologa.

Gene-specific primer: Faʻatumu i le faʻasologa o faʻasologa, talafeagai mo tulaga e iloa ai le faʻatulagaina o faʻasologa.

E lua ala:

1. Metotia faʻasino i totonu: I le teori, cDNA o DNA fragments o eseʻese uumi, o lea o le iʻuga o le electrophoresis o smear. Afai o le RNA tele e maualalo, e leai se oloa o le a faʻaalia i le electrophoresis, ae le o lona uiga e leai se oloa o le a faʻateleina e PCR. I se tulaga lautele, e mafai ona faʻaaoga se faʻamatalaga i totonu e iloa ai le cDNA. Afai o le faʻasinoga i totonu e i ai iʻuga, o le lelei o le cDNA mafai ona mautinoa mautinoa (i ni nai tulaga, pe afai o le taulaʻiga o le vaega o le genes e ono umi, e ono i ai ni tuʻusaʻoga).

2. Afai e i ai se lauiloa iloa faʻateleina e lenei faʻavae, e mafai ona faʻamaonia e le amataga o lenei kenera. O le faʻateleina o faʻamatalaga i totonu e le o lona uiga e leai se faʻafitauli ma le cDNA. Talu ai o faʻamatalaga i totonu e maualuga tele i le cDNA, e faigofie ona faʻateleina. Afai o le cDNA e faʻaletonu vaega mo mafuaʻaga eseese, mai le manatu o le ono mafai, PCR taunuʻuga o le maualalo tele gaioiga genes o le a matua afaina. E ui o loʻo maualuga pea le tele o faʻamatalaga i totonu, ae o le a le afaina le faʻateleina.

Faʻaleagaina le RNA. Maua le amio saʻo ma faʻamama le RNA

O le RNA 'anotusi o ituaiga' eseʻese atonu e 'eseʻese, ae i se tulaga lautele, o le aofaʻiga o le RNA tatau ona aofia ai lua manino 28S ma 18S fusi i gel electrophoresis, ma o le susulu o le paʻu muamua e tatau ona faaluaina maualuga nai lo le mulimuli. O le faʻaaliga 5S faʻaalia ai o RNA ua faʻaleagaina, ma o lona susulu e faʻatusatusa i le tikeri o le faʻaleagaina. O le faʻamanuiaina manuia o faʻamatalaga i totonu e le o lona uiga e leai se faʻafitauli ma le RNA, aua o le faʻamatalaga i totonu e maualuga tele, e mafai ona faʻateleina le RNA pe a le ova le faʻaleagaina. O le FA₂₆₀/ FA₂₈₀fua faatatau o le mama RNA fuaina e le spectrophotometer tatau ona i le va o 1.9 ma 2.1. O se aofaʻi laʻititi o polotini le mama i le RNA o le a faʻaititia ai le fuataga. Afai lava e le maualalo le tau, o le a le afaina le RT. O le mea e sili ona taua mo le RT o le RNA faʻamaoni.

O le faʻaopopoina o le gafa faʻasino i totonu e mafai ona faʻailoa mai ua manumalo le RT, ae le faʻapea e fesoʻotaʻi ma le lelei o le fua o le cDNA. Talu ai o vaega i totonu e masani ona laʻititi i le lapopoʻa ma maualuga i faʻamatalaga, e faigofie ai ona alualu i luma i tua faʻamatalaga. Peitaʻi, o le tele ma le faʻaaliga o le sini autu e eseʻese mai le kenera i le isi ituaiga. O le cDNA lelei e le mafai ona faʻamasinoina naʻo faʻamatalaga i totonu aemaise lava mo vaega taulaʻi umi atu ile 2 kb.

O nisi faʻataʻitaʻiga e faigata ona fausiaina tulaga lua, pe mauʻoa GC mea taua, pe taua ma maualalo tele. I nei tulaga, tatau ona filifilia transcriptase toe faʻafetaui talafeagai e tusa ma le tele o le vaega faʻatulagaina ma le faʻataʻitaʻiga. Mo RNA faʻataʻitaʻiga ma maualuga GC mataupu ma laʻitiiti tulaga lua fausaga, e faigata ona tatalaina le lona lua fausaga i le maualalo vevela, poʻo ma masani fesuiaʻi transcriptase. Mo nei faʻataʻitaʻiga, e mafai ona filifilia le Quant Reverse Transcriptase, talu ai o lona toe faʻaliliuina o gaioiga e mautinoa lona sili atu nai lo le M-MLV series reverse transcriptase, lea e mafai ona toe faʻaliliuina lelei le tusiaina o RNA faʻataʻitaʻiga lelei ma faʻasolosolo le RNA i le cDNA muamua fua i le maualuga lautele. Pe a faʻaaogaina le lautele fesuiaʻi transcriptase pusa, 20 μl faiga e mafai ona na o le faʻaleleia o le transcript 1 μg o le aofaʻi RNA. Faʻamolemole faʻalogo i le maualuga RT gafatia o pusa. Afai o le template ua faʻaopopo sili atu, suia faʻaliliuga o le a fiafia i le RNA ma maualuga tele. O le mea lea, e sili atu le le sili atu i le maualuga gafatia o le polokalama.

A-1 Vaʻai pe a fai e faʻaleagaina le RNA ma afai e manuia le RT

I se tulaga lautele, o le mafuaʻaga mo le le manuia o totonu faʻalauteleina amplification e masani ona mafua mai i le ogaoga RNA faʻaleagaina. O leisi mafuaʻaga talafeagai o le toe sui faʻaletonu o tusitusiga. E le mafai ona faʻaaoga se faʻamatalaga i totonu e fai ma faʻataʻitaʻiga e faʻamasino ai le tulaga lelei o le cDNA tasi fuafuati, ae mafai ona faʻaaogaina o se tulaga masani e faʻamasino ai pe a faʻasolosolo tusitusiga e faʻamanuiaina pe a fai e leai se faʻafitauli o le lelei ole RNA. O le mea sili ona taua ile faʻasologa o faʻaliliuga ole tausiga ole tumau pea ole vevela ma le faʻaauau pea ona tali atu ina ia mafai ona faʻaleleia le lelei ole tali atu.

A-2 Fuafua pe o faʻavae mo le faʻalauteleina o totonu genes faʻamaoniga e faʻatuatuaina ma pe i ai ni faʻafitauli ma reagents faʻaaogaina i PCR.

Mo le faʻatusatusaina, o le RNA e tatau ona faʻatusalia i luma o le toe faʻaliliuina, o loʻo manaʻomia foʻi i le tele o faʻasologa o toefaʻamatalaga, mo se faʻataʻitaʻiga, faitau le sao ole RNA ile 1 μg. Talu ai o le liliu faʻasolosolo cDNA o se fefiloi vaifofo, e aofia ai le RNA, oligo dT, enzyme, dNTP, ma e oʻo lava i sina DNA totoe, o le a mafua ai le faʻaletonu, o lea e faigata ai ona fuaina saʻo le cDNA. O le mea lea, RNA aofaʻi talafeagai e talafeagai. Mafaufauga i le fesuiaʻiga o faʻamatalaga tusitusia e tutusa i vaʻaiga eseese, o le aofaʻi o cDNA maua e tatau ona tutusa, ma le aofaʻi auiliiliga mafai faʻaalia ai le faʻatusatusaga o faʻaaliga tulaga o kenera eseese i le tutusa aofaʻi o le aofaʻi RNA. Pe a faʻatinoina le fesuiaiga o fuainumera PCR, tele cDNA ono le manaʻomia pe a maeʻa le toefaʻailoga aua o le loto i totonu faʻamatalaga mafai ona avea ma faʻasino.

E masani ona fesoʻotaʻi i genes, ma fesuiaʻi tusitusiga o le umi fasi e le mafai mo le tele o genes. Muamua lava, o le aoga o le toe faʻaliliuga o tusitusiga e sili mamao atu le maualalo nai lo le PCR. Lona lua, o le GC mauoa itulagi ma tulaga lua faʻatulagaga o le tele o genes faʻatapulaʻa uma i tua faʻaliliuga ma PCR. I le iuga, o le faʻamaoni ma le faʻateleina lelei o PCR e faigata ona mautinoa i le taimi e tasi. I le faʻagasologa o le toe faʻaliliuina o tusitusiga, e leai seisi na te mafaia ona mautinoa ia maua ni vaega umi mo le maualalo o kopi o kenera, aemaise lava le faʻaaogaina o le oligo dT. A o le 5 'UTR ma le tele o le GC, e sili atu ona faigata. O le mea lea, o se auala talafeagai e toe fesuiaʻi tusitusiga ma soʻo se mea muamua, saili le natura vaeluaina nofoaga i le faʻatulagaina fasi, faʻalauteleina e vaega, ona faʻatinoina ai le tapulaa digestion ma ligation. I se tulaga lautele, e faigata ona faʻalauteleina faʻalautelega vaega sili atu nai lo le 2 kb, ae e le mafai i taimi uma ona mauaina: 1.Faamuamua lava, mautinoa le faʻamaoni o le RNA / mRNA, ma le TRIZOL aveʻesega e sili atu. 2.M-MLV RT-PCR pusa mafai ona faʻaaoga saʻo. Faʻalautele le tuʻufaʻatasi taimi ma faʻateleina le taʻamilosaga numera ile faʻateleina faʻalelei auala. A le o lea, PCR faʻapipiʻi mafai ona faʻaogaina, pe faʻatino se tasi pe lua ni tali muamua ma le talafeagai faʻalauteleina denaturation ma faʻalautelega taimi i luma o masani PCR faʻateleina, lea e mafai ona fesoasoani e faʻalautele vaega. Faalogo i le faʻamaoni o le polymerase. 3.Long Taq e mafai ona faʻaaogaina i le PCR e maua ai ni faʻaiuga lelei. 4. Mo faʻatinoga o faʻamatalaga polotini, e tatau ona faʻaaogaina le maualuga o le faʻamaoni polymerase.

E lua ituaiga toe fesuiaʻiga transcriptase ofo mai e TIANGEN: Quant / King RTase ma TIANScript M-MLV. O le eseʻesega tele i le va o latou o le aofaʻi o sao o template. O le Quant o se tulaga ese faʻasolosolo transcriptase, lea e ese mai le masani ona faʻaaogaina M-MLV na maua mai Moloney murine leukemia siama. Quant o se fou maualuga-lelei toe fesuiaʻi transcriptase toe faʻaalia e le inisinia Escherichia coli. O le Quant e talafeagai mo le faʻateleina o le 50 ng-2 μg o le RNA ma le maualuga o le faʻasolosolo o gaioiga ma le fua tele. Faʻatusatusa i MMLV masani poʻo AMV, o le Quant sili ona uiga o le e matua malosi vavalalata ma RNA faʻataʻitaʻiga ma mafai fesuiaʻi transcript laʻasaga template e aunoa ma le maualuga vevela denaturation. Mo faʻataʻitaʻiga e maualuga atu mea o loʻo i totonu o le GC, e maualuga le faʻasolosolo lelei. Ae ui i lea, o lenei faʻaliliuga transcriptase o loʻo iai le RNase H gaioiga, lea e ono aʻafia ai le umi o le cDNA oloa (talafeagai mo <4.5 kb faʻataʻitaʻiga). Mo masani faʻasolosolo tusitusiga, TIANScript MMLV liliu faʻasolosolo e fautuaina. Lenei RTase o se fesuiaʻiga enzyme ma vaivai tele RNase H gaioiga, lea e talafeagai mo le umi (> 5 kb) cDNA synthes.

E tasi le laʻasaga faʻasolosolo tusitusi ma PCR faʻateleina ua maeʻa i le tutusa paipa e aunoa ma le tatalaina o le ufiufi paʻu i le va o cDNA synthesis ma amplification, e aoga e faʻaititia ai faʻaleagaina. Talu ai o faʻataʻitaʻiga uma cDNA maua mai e faʻaaogaina mo le faʻateleina, o le lagona e sili atu le maualuga, ma le maualalo o le 0,01 pg o le aofaʻi o RNA. Mo le manuia tasi laʻasaga RTPCR, gafa-faʻapitoa primers e masani ona faʻaaogaina e amataina cDNA synthesise. O le lua-sitepu metotia, e taʻua o le fesuiaʻiga o tusitusiga ma le PCR amplification o loʻo faʻatinoina i ni laʻasaga se lua. Muamua fesuiaʻiga transcription o loʻo faʻatinoina mai le RNA template e maua ai cDNA, ma o le mauaina cDNA e faia i se tasi pe sili atu eseese PCR tali atu. O le lua-sitepu metotia mafai ona faʻaaogaina le oligo (dT) poʻo ni mea muamua e faʻataʻitaʻiina le tuʻufaʻatasia o le uluaʻi fua o le cDNA, ma mafai ona suia faʻamatalaga uma mRNA mai se faʻapitoa faʻataʻitaʻiga.